納米孔傳感器可以檢測通過納米孔的離子電流變化，實現(xiàn)單分子靈敏度，已成功用于檢測生物標(biāo)志物，包括核酸、蛋白質(zhì)和小分子。但在對超低濃度（亞皮摩爾）分子進行定量分析時，面臨響應(yīng)時間長的問題，因為分析物擴散到納米孔的時間常數(shù)與分子必須擴散的距離成平方。同時，在復(fù)雜的樣品中，如生物體液，樣品中通過納米孔傳感器易位的其他物質(zhì)也會在離子電流中表現(xiàn)出電阻脈沖，這意味著臨床樣品的選擇性可能是一個挑戰(zhàn)。

為了克服這些挑戰(zhàn)，來自于澳大利亞新南威爾士大學(xué)的研究人員提出了一種光學(xué)納米孔阻斷傳感器方法，能夠快速檢測超低濃度的物質(zhì)。

研究人員使用的模型分析藥物是血管內(nèi)皮生長因子（VEGF），將熒光聚苯乙烯納米顆粒（PSNPs）用抗VEGF抗體修飾，形成Ab-PSNPs，而納米孔陣列的表面用抗VEGF適配體修飾，形成適配體納米孔，通過在納米孔上施加電場，將Ab-PSNP帶到適配體納米孔中。通過計算納米孔陣列（676個納米孔）中阻斷與解阻事件的比率，量化亞皮摩爾濃度下的VEGF量。

研究人員沒有通過離子電流的變化來確定阻斷事件，而是利用熒光納米顆粒和寬視場顯微鏡作為讀出機制，從而實現(xiàn)可同時監(jiān)測數(shù)百個納米孔，顯著增加了可檢測到的阻斷事件的數(shù)量，使納米孔阻斷傳感器實現(xiàn)定量。

首先，研究人員在沒有任何表面修飾的情況下，用裸露的納米孔測量裸露的PSNP的封閉事件。當(dāng)不施加電壓時，沒有熒光信號；當(dāng)向反式室施加1.5 V的電壓時，觀察到許多熒光信號，證明通過電場可以將納米顆粒驅(qū)動進入納米孔。

為了增強納米孔表面的抗污染性能，以減少非特異性結(jié)合，研究人員研究了納米孔表面化學(xué)功能化，以及非特異性顆粒從不同直徑納米孔中移除的去除效率。實驗成功地展示了通過電場控制可以區(qū)分特異性和非特異性結(jié)合的事件，且通過選擇合適的納米孔直徑和電場條件，可以有效地移除非特異性結(jié)合的納米顆粒，提高了傳感器的選擇性和準(zhǔn)確性。

接下來，研究人員展示了根據(jù)可以從孔隙中去除的顆粒數(shù)量（非特異性事件）和施加負(fù)電壓時留在孔中的顆粒數(shù)量（特定事件）來檢測目標(biāo)蛋白質(zhì)VEGF的能力。實驗結(jié)果表明，利用光學(xué)納米孔阻斷傳感器可以成功區(qū)分特異性和非特異性事件，通過計算施加負(fù)電壓后留在孔中的顆粒百分比，可以定量分析VEGF的濃度。

最后，研究人員使用不同濃度的VEGF與固定濃度的Ab-PSNP進行定量檢測實驗，所用VEGF濃度從0到7.895 pM，在不同濃度下，Ab-PSNP與VEGF的結(jié)合比率如下圖所示。同時，實驗?zāi)軌驒z測的VEGF濃度為78.75 fM（3 pg/mL）。

總之，研究人員展示了一種在高密度納米孔陣列（676個納米孔）中獨立監(jiān)測熒光納米顆粒阻斷/解阻事件的技術(shù)，可用于使用單分子計數(shù)來定量分析超低濃度的分析物，并證明了其在亞皮摩爾范圍內(nèi)定量蛋白質(zhì)VEGF的能力。

未來，該技術(shù)可能擴展到其他在生物樣本中以超低濃度存在的分析物的檢測，通過增加檢測的納米孔數(shù)量，可以提高檢測的靈敏度。

來源：傳感器專家網(wǎng)